Terapia restaurativa nella Malattia di Parkinson.
Chirurgia dei trapianti cellulari.
Dr.ssa M. Pierantozzi, dott. Paolo Stanzione
Servizio di Neurofisiopatologia Policlinico di Tor Vergata, Università di Tor Vergata, Roma
Sesta Giornata Mondiale del Parkinson.
Roma, 16 marzo 2002


Introduzione

E' noto che i primi sintomi della Malattia di Parkinson si manifestano generalmente quando circa l'80-85% delle fibre dopaminergiche è ormai degenerato, da qui l'importanza di sviluppare delle nuove strategie terapeutiche volte a salvaguardare i neuroni dopaminergici residui ed a stimolare una loro ricrescita o sprouting al fine di migliorare il deficit della trasmissione dopaminergica presente nei pazienti parkinsoniani. La cosiddetta terapia ristorativa o restaurativa cerca di rispondere a queste necessità. Tale approccio terapeutico, pur essendo prevalentemente costituito da strategie ancora sperimentali, rappresenta un fondamentale passo avanti nel tentativo di superare la terapia sintomatologica e realizzare una terapia eziologia per la malattia di Parkinson. Il fulcro della terapia restaurativa è infatti basato sulla eventualità di riparare o ripristinare la funzione dei neuroni dopaminergici con mezzi farmacologici o biologici (terapie geniche), e sulla possibilità di sostituire i neuroni degenerati con nuove cellule in grado di produrre autonomamente dopamina. Negli ultimi anni la chirurgia dei trapianti cellulari ha suscitato un crescente interesse negli ambienti della ricerca scientifica e numerosi studi clinici sono stati condotti da diversi gruppi di ricercatori in vari paesi del mondo.

Trapianti cerebrali di cellule: fasi precliniche

Nell'ambito dei trapianti cerebrali le cellule maggiormente utilizzate sono le cellule adrenergiche della midollare del surrene e, più recentemente, le cellule fetali di mesencefalo ventrale. In entrambi i casi, il miglioramento clinico aspettato può essere ricondotto a due meccanismi principali: i) la produzione di dopamina da parte delle cellule trapiantate; ii) la stimolazione del sistema dopaminergico dell'ospite (sprouting) indotto delle nuove cellule trapiantate. E' da sottolineare che in tutti i modelli animali e negli studi clinici condotti nell'uomo la sede del trapianto non è la sostanza nigra, naturale sede di produzione della dopamina (DA), ma il corpo striato, struttura anatomica fondamentale dei nuclei della base, formata dai nuclei Caudato e Putamen. Il corpo striato costituisce il target finale per l'azione delle cellule dopaminergiche normalmente presenti nella sostanza nera in quanto la DA prodotta da queste cellule viene liberata proprio a livello dei neuroni del corpo striato per regolarne l'attività. Il perché siano stati effettuati sempre trapianti intrastriatali si può ricondurre a diverse motivazioni tra cui le difficoltà anatomiche, le dimensioni dei diversi nuclei, la necessità di ridurre lo spazio e quindi il tempo necessari ai terminali rigenerati per raggiungere lo striato e liberare la DA, le difficoltà proprie di attecchimento nella sostanza nigra. In un recente lavoro (Baker et al 2000) è stato riportato di un doppio impianto intranigrale e intrastriatale, effettuato in topi resi parkinsoniani, cui sarebbe seguito un netto miglioramento dei sintomi extrapiramidali.
Si può pertanto affermare che il miglioramento dei sintomi clinici della malattia di Parkinson auspicato da tutti i procedimenti di trapianto cellulare effettuati nei gangli della base è legato alla possibilità di una consistente sopravvivenza delle cellule trapiantate nel tessuto cerebrale ospite, alla successiva formazione di connessioni sinaptiche con i neuroni preesistenti e quindi alla ricostituzione di una migliore rete neurale che permetta una maggiore produzione di dopamina endogena da parte delle nuove cellule trapiantate e di quelle dell'ospite stesso.
La possibile applicazione clinica dei trapianti di cellule nevose nelle patologie degenerative che colpiscono il sistema extrapiramidale è stata suggerita circa 20 anni fa quando fu osservato che il tessuto mesencefalico fetale di ratto impiantato nel nucleo striato di topi resi parkinsoniana poteva ridurre i sintomi della malattia (Perlow et al 1979). Questa prima pionieristica, entusiasmante osservazione è stata seguita da numerosissimi studi condotti su roditori e su primati.
Non tutti gli studi effettuati nei roditori hanno tuttavia confermato la reale efficacia a lungo termine delle procedure di trapianto, sia delle cellule di midollare di surrene, sia di quelle fetali mesencefaliche, forse a causa di una scarsa integrazione tra le cellule trapiantate ed il tessuto cerebrale dell'ospite (Date 1990; Freed 1992; Bergdall 1994).
Migliori risultati sono stati invece ottenuti nei primati, dove è stato dimostrato che scimmie rese parkinsoniane in seguito al trattamento con MPTP, presentavano un persistente miglioramento dei sintomi clinici dopo trapianto di cellule fetali di mesencefalo ventrale in grado di produrre dopamina (Elsworth 1997).
Nell'ambito dei trapianti esistono numerosi problemi pratici e molteplici difficoltà che devono essere prese in seria considerazione, prima tra tutte la scarsa sopravvivenza delle cellule trapiantate è infatti importante sottolineare che circa l'80-95 % delle cellule trapiantate può andare incontro a fenomeni degenerativi, la così detta morte lenta per apoptosi, nei primi giorni dopo l'intervento.
La possibilità di migliorare la sopravvivenza delle cellule trapiantate e di ridurne quindi la morte nelle prime fasi post-intervento è legata alla scoperta ed alla utilizzazione dei cosiddetti fattori trofici. Con questo termine si indicano dei fattori biologici che esercitano una azione protettiva sulle cellule e che possono essere facilmente aggiunti nelle culture cellulari da impiantare rendendo le cellule meno vulnerabili.
Tra i numerosi fattori trofici utilizzati negli ultimi anni nei diversi studi in modelli animali ricordiamo principalmente: le citochine (Carvey 2001), diversi tipi di fattori neurotrofici prodotti dalle cellule gliali, (Sortwell et al 2000; Zawada et al 1998), vari tipi di lipidi ad azione antiossidante tra cui i lazaroidi che inibiscono le perossidasi e quindi la formazione di radicali liberi ed i conseguenti fenomeni ossidativi cellulari (Hasson et al2000; Nakao et al 1994), gli inibitori enzimatici delle proteasi come le caspasi in grado di bloccare i fenomeni di proteolisi alla base della distruzione delle cellule (Schierle et al 1999).
L'importanza dei fattori trofici è notevole se si tiene presente che aumentando la percentuale di sopravvivenza delle cellule trapiantate si riduce la quantità di tessuto embrionale umano richiesto per ogni trapianto. E' inoltre basilare migliorare le strutture operatorie attuali realizzando strumentazioni sempre più raffinate e ridurre le difficoltà legate alla conservazione del tessuto mesencefalico embrionale fino al momento del trapianto (studi in modelli animali hanno infatti dimostrato che la criopreservazione potrebbe rendere il trapianto inefficace).

Trapianti cerebrali di cellule: studi clinici nell'uomo

A partire dai primi anni novanta, sulla base dei numerosi studi preclinici effettuati nei modelli animali, sono stati eseguiti numerosi trapianti di cellule con proprietà dopaminergiche in pazienti affetti da Malattia di Parkinson utilizzando sia cellule della midollare del surrene prelevate dagli stessi pazienti, trapianti omologhi, sia cellule embrionali di mesencefalo ventrale prelevate da tessuto fetale, trapianti eterologhi.

Trapianti di cellule della midollare del surrene

Gli studi basati sul trapianto di cellule della midollare del surrene hanno preceduto quelli che utilizzano le cellule fetali di mesencefalo ventrale e sono stati in parte abbandonati per presenza di una scarsa sopravvivenza delle cellule trapiantate e quindi per l'elevato rischio di declino del miglioramento clinico iniziale (Madrazo, 1987e 1991; Fazzini et al 1991; Chung et al 1994). In particolare, i risultati relativi ad uno studio multicentrico americano condotto su 61 pazienti hanno mostrato come dopo due anni dal trapianto il 18 % dei pazienti era deceduto, il 22% aveva manifestato varie complicanze psichiatriche (confusione mentale, agitazione, psicosi) e solo il 19% presentava un miglioramento della sintomatologia clinica caratterizzato soprattutto da una maggiore durata della fase ON e da una relativa riduzione della gravità dei sintomi (Goets et al 1991). In questo ultimo gruppo di pazienti, tuttavia, l'allungamento della fase ON giornaliera e la riduzione dei sintomi clinici era ancora presente dopo altri due anni di osservazione facendo pensare ad un possibile rallentamento nella progressione di malattia (Diamond et al 1994).
In sintesi, i trapianti di cellule della midollare del surrene presentano scarse implicazioni di tipo etico, in quanto si tratta di trapianti autologhi, cioè basati sul trapianto di cellule appartenenti sempre allo stesso paziente), e la loro efficacia dovrebbe essere assicurata dalla loro capacità di stimolare il sistema dopaminergico dell'ospite attraverso l'induzione di nuovi contatti sinaptici con le cellule dopaminergiche residue. D'altra parte, i risultati clinici fino ad ora riportati con questo tipo di trapianto non sono stati particolarmente incoraggianti considerando l'elevata morbilità e mortalità osservata e la variabilità e transitorietà della risposta clinica (1-2 anni) nel tempo, quest'ultimo dato sicuramente dovuto alla difficile sopravvivenza cellule nel nucleo striato. Si deve tuttavia ricordare che negli ultimi anni la possibilità di aumentare la sopravvivenza delle cellule in coltura mediante l'aggiunta di fattori trofici ha rinnovato l'interesse per questo tipo di trapianto.

Trapianti di cellule fetali mesencefaliche embrionali

Esistono numerosi studi clinici relativi al trapianto di cellule FVM nell'uomo. La maggior parte di tali studi è stata tuttavia limitata ad un esiguo numero di pazienti, compresi tra 1 e 10 casi (Freed et al 1990 e 1992, Neng et al 1992, Lindvall et al 1990, Hoffer et al 1992, Lopez-Lozano et al 1997)
Tutti questi studi sono condotti in pazienti in fase avanzata di malattia, con una lunga storia farmacologica, fluttuazioni motorie, fenomeni di tipo ON-OFF e discinesie indotte dal trattamento con levodopa. Benché in nessuno di questi studi sono stati riportati gravi effetti collaterali, i miglioramenti clinici osservati nei primi mesi dopo il trapianto sono stati variabili e la loro durata si è rivelata spesso transitoria. La variabilità dei risultati relativi a questi studi può essere ascritta alla mancanza di omogeneità nelle procedure utilizzate e quindi ai diversi approcci chirurgici effettuati, alla quantità ed all'età del tessuto fetale trapiantato, all'uso di immunosoppressori, alle caratteristiche epidemiologiche dei pazienti che possono aver condizionato la sopravvivenza delle cellule nel tessuto dell'ospite.
I risultati a lungo termine (quattro anni di osservazione) del primo studio relativo al trapianto di cellule fetali di mesencefalo ventrale condotto su un elevato numero di pazienti con caratteristiche cliniche ed epidemiologiche ben definite, sono stati recentemente pubblicati da alcuni ricercatori americani (Freed et al 2001). In questo studio sono stati esaminati e seguiti 40 pazienti che presentavano una lunga storia di malattia, una buona risposta alla levodopa nei primi anni di trattamento, l'assenza di deterioramento cognitivo, di allucinazioni e di altre patologie del sistema nervoso centrale. L'intero gruppo di pazienti è stato quindi suddiviso in due sottogruppi sopra e sotto i 60 anni al fine di poter valutare obiettivamente l'effetto dell'età dei pazienti sulla positività del trapianto. A differenza degli studi precedenti, questo studio Ë stato condotto in condizioni di doppio cieco in quanto il trapianto di cellule è stato effettuato solo in 20 dei 40 pazienti, scelti casualmente nei due sottogruppi con più o meno di 60 anni. La condizione di doppio cieco è molto importante perché esclude l'influenza personale ed assicura una maggiore attendibilità dei risultati osservati in quanto sia i medici, sia gli stessi pazienti, non sapevano in quali pazienti il trapianto fosse stato realmente realizzato. In base questo disegno, le cellule fetali sono state impiantate in sede intrastriatale in 20 pazienti, mentre negli altri 20 l'intervento chirurgico è stato effettuato senza impianto di cellule. L'intervento è avvenuto in condizioni di anestesia locale ed ogni paziente deputato al trapianto ha ricevuto il tessuto fetale proveniente da un singolo embrione attraverso due cannule inserite per via frontale bilateralmente. Non sono stati osservati effetti collaterali peri-operatori e nessuno dei pazienti ha assunto immunosoppressori.
I pazienti sono stati rivalutati 12 mesi dopo l'intervento. Il quadro clinico è stato studiato utilizzando numerose scale di valutazione, mentre la sopravvivenza delle cellule trapiantate è stata esaminata mediante degli studi PET con fluorodopa in grado di visualizzare l'attività dopaminergica all'interno del corpo striato. I risultati delle valutazioni cliniche hanno mostrato un miglioramento significativo della sintomatologia parkinsoniana, soprattutto della rigidità e della bradicinesia, ed un significativo allungamento della durata della fase di ON giornaliero solo nei pazienti giovani (età inferire o pari a 60 anni) che avevano realmente subito trapianto cellulare. D'altra parte, è importante notare che, a differenza della clinica, gli studi PET hanno chiaramente dimostrato una buona sopravvivenza e funzionalità delle cellule trapiantate in tutti i pazienti indipendentemente dall'età.
Finita la fase in doppio cieco, durata un anno, i pazienti sono stati informati sulle procedure chirurgiche effettuate e sono stati nuovamente valutati dopo altri 3 anni dall'intervento. Questi nuovi dati, di recente pubblicazione, hanno confermato l'assenza di qualsiasi miglioramento clinico nei pazienti con più di 60 anni e la persistenza di un significativo miglioramento dei sintomi parkinsoniani nei pazienti giovani, ma hanno anche segnalato l'insorgenza di gravi effetti discinetici in 5 pazienti giovani che non si sono ridotti neanche dopo la completa sospensione della terapia dopaminergica.
In sintesi, i dati di questo importante studio condotto per la prima volta su un ampio gruppo di pazienti dimostrano che le cellule embrionali sono in grado di sopravvivere a lungo nei nuclei striati, come confermano gli studi PET con fluorodopa, e di accrescersi nel putamen di tutti i pazienti, indipendentemente dalla loro età e dalla mancanza di immunosoppressione. Tuttavia tale obiettività anatomica non si associa sempre ad un reale miglioramento clinico perché la presenza di un persistente miglioramento dei sintomi extrapiramidali è stata osservata solo nei pazienti con un'età inferiore ai 60 anni, forse per una minore plasticità dei neuroni dei pazienti più anziani.
Nei pazienti giovani deve essere tenuto ben presente il possibile rischio di discinesie violente, che potrebbe essere legato ad un eccessiva attività dopaminergica delle cellule trapiantate, forse legata alla sede di trapianto o alla difficoltà nel controllare l'espansione delle nuove cellule.

Nuove prospettive

Negli ultimi tempi, in relazione alle problematiche etiche legate alle procedure terapeutiche che utilizzano cellule embrionali, si Ë cercato di individuare ed isolare nuove linee cellulari che potessero avere delle caratteristiche utili nel ripristinare la trasmissione dopaminergica senza dover ricorrere a tessuto e fetale. Sulla base di recenti studi effettuati in modelli animali di roditori (1995) sono stati riportati miglioramenti della sintomatologia parkinsoniana in pazienti sottoposti a trapianto unilaterale intrastriatale di tessuto preso per via endoscopica dal ganglio cervicale toracico degli stessi pazienti. Si tratta però di casi isolati in cui manca l'osservazione a lungo termine.
Altri studi hanno invece rinnovato l'interesse per il trapianto di cellule della midollare del surrene, suggerendo che l'aggiunta di cellule di nervo periferico dovrebbe rendere il trapianto più efficace in quanto le cellule di nervo periferico dovrebbero agire da fattori trofici per le cellule della midollare, aumentandone l'accrescimento e la sopravvivenza, e favorire il recupero delle funzioni dopaminergiche residue delle cellule dell'ospite. Anche in questo caso è però necessaria una osservazione a lungo termine che confermi gli iniziali effetti positivi sulla sintomatologia.
Accanto all'utilizzazione di cellule già differenziale è attualmente di primario interesse la possibilità di poter ricorrere a cellule indifferenziate, le cosiddette cellule staminali, per ottenere risultati consistenti nelle procedure di trapianto cellulare. Come già detto uno dei maggiori problemi legato ai trapianti è la quantità di tessuto fetale necessaria per ottenere effetti terapeutici. In questo ambito la possibilità di poter utilizzare cellule staminali totipotenti, in grado cioè accrescersi in coltura in modo illimitato e di poter essere indirizzate verso una qualsiasi linea cellulare matura, rappresenta una sorgente inesauribile di cellule progenitrici da poter utilizzare per sostituire le cellule mature colpite da processi degenerativi. La caratteristica fondamentale delle cellule staminali, derivate dall'embrione a livello della blastocisti, è infatti quella di accrescersi all'infinito e di potersi differenziare in tutte le linee cellulari dell'individuo maturo. La possibilità di poter differenziare da tali cellule dei neuroni con proprietà dopaminergiche è attualmente oggetto di numerosi studi in molti modelli animali. Risultati incoraggianti provengono da studi condotti in primati resi parkinsoniani farmacologicamente che hanno riportato la spontanea maturazione di cellule embrionali staminali in cellule dopaminergiche mature, anche se la sopravvivenza di tali cellule è ancora molto bassa. Accanto alle cellule staminali totipotenti, presenti solo a livello embrionale, occorre menzionare le cosiddette cellule staminali multipotenti, cellule cioè ancora indifferenziate, ma predeterminate a differenziarsi solo in alcuni tessuti maturi e che sono normalmente presenti anche nell'individuo adulto, come ad esempio le cellule ematopoietiche del midollo osseo. Anche tali cellule sono oggetto di sempre più numerosi studi sperimentali in cui sono state tentate delle differenziazioni in senso dopaminergico con risultati molto incoraggianti.
In un futuro non troppo lontano, una volta individuati i fattori biologici in grado di indirizzare la differenziazione delle cellule staminali in cellule mature, sarà possibile ipotizzare l'uso di cellule staminali xenogene, derivate cioè da altre specie animali, e di cellule transgeniche, derivate cioè da processi biologici di laboratorio, quali sorgenti illimitate per analoghi cellulari dopaminergici anche nell'uomo. A questo proposito rimane fondamentale la necessità di individuare non solo i fattori biologici necessari a dirigere e a facilitare la maturazione delle cellule staminali verso una linea cellulare prescelta, ma anche i marcatori biologici in grado di controllarne e limitarne la trasformazione in neuroni dopaminergici. Tale eventualità si rende indispensabile per evitare una eccessiva attività funzionale delle nuove cellule differenziate che potrebbe causare una incontrollate produzione di dopamina con il rischio di gravi effetti collaterali quali irreversibili sindromi discinetiche e disturbi comportamentali.
In sintesi, i risultati ottenuti nell'ambito della chirurgia dei trapianti cellulari pur essendo molto incoraggianti ed aprendo nuove ed affascinanti prospettive nel trattamento della Malattia di Parkinson, implicano sicuramente una maggiore conoscenza delle metodiche e dei processi di replicazione cellulare e richiedono un continuo perfezionamento delle procedure chirurgiche prima di rendere un procedimento terapeutico così specifico e sofisticato una terapia abituale per la cura dei pazienti parkinsoniani.
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